“DNA damage induced by ionizing radiation activates the innate immune response: study and characterization of the cGAS-STING pathway”

Ionizing radiation (such as X-rays, gamma rays, alpha, beta particles, and neutrons) consists of electromagnetic waves or particles that can displace electrons from atoms, creating ions and potentially causing biological damage [1]. At the cellular level, this can damage DNA, leading either to cell death or to repair through cellular protective mechanisms. DNA integrity is crucial for life, as it contains essential genetic information [17]. Over millions of years, cells have evolved mechanisms known as the DNA damage response (DDR) to detect and repair DNA lesions that threaten genome stability [3]. A particularly dangerous form of DNA damage is the double-strand break (DSB), where both DNA strands are severed. Specific proteins are involved in repairing these breaks. Ionizing radiation (IR) can cause breaks in the DNA double helix, leading to micronuclei (MN) formation, which are small extranuclear structures containing chromosome fragments or whole chromosomes that were not included in the main nucleus during cell division [4]. MNi are key biomarkers of DNA damage and genomic instability, linked to various diseases, including inflammatory conditions. MNi formation can cause the nuclear envelope (NE) to rupture, exposing DNA to the cytoplasm [18]. This exposed DNA is detected by cytosolic DNA sensors, which trigger immune responses via pathways like the cGAS-STING pathway [5]. This innate immune response, stimulated by the detection of cytoplasmic DNA, results in the production of cytokines and interferons (Type-I interferons), which are critical for immune signaling [7]. Innate immunity, present from birth, is the body’s first line of defence, responding to foreign or damaged molecules via sensors such as PAMP (Pathogen- Associated Molecular Patterns) and DAMP (Damage-Associated Molecular Patterns) [6]. The cGAS- STING pathway is activated when the cGAS enzyme detects cytosolic DNA and produces cGAMP [7], which in turn activates STING, triggering immune signaling and cytokine production [7]. Recent studies have explored how DNA damage induces immune responses, in particular through the cGAS-STING pathway, which detects foreign or damaged DNA and activates inflammatory responses [6-8]. cGAS is primarily found in the cytoplasm but can also be localized in the nucleus [10]. However, the mechanisms governing its transport and activity in the nucleus are not yet fully understood and remain a subject of great interest. On the other hand, activation of the immune system, both innate and adaptive, is essential to recognise pathogens and repair tissue damage. The interaction between ionising radiation and the immune system is an emerging interdisciplinary field known as radioimmunobiology. Instead, in the context of radiation biology, low-dose radiation (LDR) has been shown to modulate immune responses [11,12]. The interaction between IR and the immune system is an emerging interdisciplinary field known as radioimmunobiology. The cellular and molecular mechanisms of radiation-induced immune responses, especially at low doses, are not well understood, making this an area of active research. The carcinogenic risk associated with low-dose radiation is debated. The traditional models for explaining the effects of low doses are rather contradictory, especially about the induced immune response. A particularly important aspect is that the second phase of these experiments was conducted on cells cultured in a BBR environment, characterized by chronic exposure and very low doses. In this environment, there were no cosmic rays, photons, or neutrons, and the only radiative contribution came from gamma rays, with an exposure level of 27 nSv/h. It is for this reason that in this study immortalized human keratinocytes (HaCaT) cells were used to explore the effects of radiation on the immune system. These experiment in natural background radiation (RomaTre University) and at the Gran Sasso National Laboratories (LNGS) was conducted. LNGS, which, due to their underground location, provide a low-radiation environment, reducing interference from cosmic rays and allowing for accurate investigations of the effects of low-dose radiation. The DISCOVER22 experiment aims to determine how low-radiation environments (LRE) affect immune responses, specifically examining the activation of the cGAS-STING pathway following radiation-induced DNA damage. Part of this work focused on studying the effects of IR on the cGAS-STING pathway. Subsequently, the research aimed to understand how and whether the near absence of natural background radiation could alter certain aspects of this systemic response following an external insult represented by exposure to ionizing radiation doses. Based on previous studies, dose-dependent and time-dependent experiments of total and cGAS+ MNi after X-ray have been carried out. The study aimed to explore the relationship between total radiation induced damage and cGAS activation kinetics. The results showed a dose-dependent increase in MNi, as reported in literature, after exposure to X-rays, and significant induction of cGAS+ MNi after treatment. The research confirmed that the number of total MNi peaked at 24 hrs after irradiation, but the number of cGAS+ MNi was kept constant over time. An interesting aspect of the work was the role of nuclear envelope integrity in cGAS activation. The study found that most cGAS+ MNi lost the integrity of B1 sheet after 24 h post-radiation, exposing the DNA to cytosol and allowing recognition of cGAS. This result confirms the hypothesis that the rupture of the NE is a key, though not essential, event in the activation of cGAS. In addition, the study examined the relationship between cGAS+ MNi induction and innate immune response by measuring the production of type I interferons (IFN-α and β) and expression of the ISG15 protein, which are crucial in innate immune signaling. Data showed a significant increase in interferons and ISG15 72-120 hrs after exposure to 4 Gy of X-rays, suggesting that radiation-induced DNA damage leads to immune activation via cGAS-STING. In previous experiments at the RomaTre laboratories, it was found that the percentage of cGAS+ MNi induction was 11-15% in both control and irradiated samples. Based on these results, experiments have been started to determine whether, as suggested in the literature [15,16], ionising radiation (IR) is not only affect the total MN but also the cGAS+ MN and thus affect the immune system through the presence of inductible factors. The medium from irradiated cells was transferred to untreated cells to see if it induced cGAS+ MNi. Various combinations of irradiated and non- irradiated cells were tested. Results showed a statistically significant increase in total MNi and cGAS+ MNi in samples that received irradiated medium. Notably, the control sample receiving irradiated medium also showed significant induction of cGAS+ MNi on total MNi, suggesting a bystander effect. This indicates that cGAS recognizes free DNA through a mechanism involving diffusible factors released into the medium, warranting further investigation. Additionally, experiments conducted at the Gran Sasso National Laboratories (LNGS) under ultra- low radiation environments (LRE) and with chronic exposure aimed to understand how reduced natural background radiation (NBR) affects the immune response. Cells were cultured under both NBR and BBR (reference background radiation) conditions for up to 60 days. Results indicated no significant differences in cell growth, but a delayed response in cGAS activation was observed under BBR conditions, suggesting that background radiation influences the timing of the immune response. The induction of total MNi after varying adaptation times (20-40-60 days) showed no change following 1 Gy of X-ray exposure when comparing natural background radiation (NBR) to below background radiation (BBR) conditions, but a delayed response in cGAS activation to MN and protein transport from nucleus to cytoplasm under BBR conditions was observed, suggesting that background radiation affects the timing of the immune response. In NBR, the induction of cGAS+ MNi peaked at 48 h after exposure, while in BBR the induction profile was similar but shifted by 48 h, indicating a delayed induction of cGAS into BBR. In addition, total induction of MNi did not correlate with induction of cGAS, as it remained unchanged in both conditions. Summing up, despite the different timing, the peak levels of cGAS+ MNi remained consistent, indicating a delayed cGAS induction in BBR. Interestingly, the study found that cGAS+ MNi peaked at different times depending on the radiation conditions, with a delay under BBR compared to NBR. This delay was not due to DNA damage or changes in cGAS transcription levels but likely resulted from slower nucleo-cytoplasmic transport of the cGAS protein under BBR conditions. This finding highlights a potential difference in the mechanisms of cGAS activation between different radiation environments. In view of this possible delayed transport, we wanted to test whether the activation of the innate immune system was also affected by it. RT-qPCR for α and β interferons and Western blot for expression of ISG15 revealed innate immune activation in both conditions, with higher levels of activation in the post-treatment in BBR. In particular, ISG15, a protein stimulated by the direct production of interferons, showed a significant increase even at 168 h after 4 Gy in BBR compared to NBR, where instead its expression begins to decrease. This indicates that ISG15 and cGAS activity may be regulated by more complex mechanisms, with BBR conditions influencing cGAS transport and immune response timing. In conclusion, the research provides important insights into how radiation influences DNA damage, immune activation, and the role of background radiation in modulating these processes. It emphasizes the complexity of cGAS activation and suggests further studies are needed to fully understand the mechanisms at play, particularly in different radiation environments. In-depth knowledge of the cGAS-STING pathway could bring new evidence to light on the mechanisms behind DNA damage recognition and inborn immune system activation. Understanding this pathway better would help to explain the mechanisms behind our evolution and use this knowledge for next-generation cancer therapies.

Le radiazioni ionizzanti (come i raggi X, i raggi gamma, le particelle alfa e beta e i neutroni) sono onde elettromagnetiche o particelle che possono spostare elettroni dagli atomi, creando ioni e potenzialmente causando danni biologici [1]. A livello cellulare, ciò può danneggiare il DNA, portando o alla morte cellulare o alla riparazione tramite meccanismi protettivi cellulari. L'integrità del DNA è cruciale per la vita, poiché contiene informazioni genetiche essenziali [2]. Nel corso di milioni di anni, le cellule hanno sviluppato meccanismi noti come risposta al danno del DNA (DNA Damage Response, DDR), che rilevano e riparano le lesioni del DNA che minacciano la stabilità del genoma [3]. Una forma particolarmente pericolosa di danno al DNA è la rottura a doppio filamento (Double-Strand Break, DSB), in cui entrambi i filamenti del DNA vengono recisi [4]. Proteine specifiche sono coinvolte nella riparazione di queste rotture. Le radiazioni ionizzanti possono causare DBS che non o mal riparate possono portare alla formazione di micronuclei (MNi), piccole strutture extranucleari contenenti frammenti cromosomici o cromosomi interi non inclusi nel nucleo principale durante la divisione cellulare [5]. I MNi sono importanti biomarcatori di instabilità genomica, associati a varie malattie, incluse condizioni infiammatorie. In seguito alla sua formazione, l’involucro nucleare può rompersi esponendo il DNA al citoplasma [5]. Questo DNA esposto viene rilevato da sensori del DNA citosolico, che innescano risposte immunitarie tramite vie come quella del pathway cGAS-STING [5]. Questa risposta immunitaria innata, stimolata dalla rilevazione del DNA citoplasmatico, porta alla produzione di citochine e interferoni, fondamentali per l’attivazione dei corretti segnali immunitari [6–8]. L'immunità innata, presente dalla nascita, è la prima linea di difesa del corpo, rispondendo a molecole estranee o danneggiate tramite sensori come i PAMP (Pathogen-Associated Molecular Patterns) e i DAMP (Damage-Associated Molecular Patterns) [6]. Il pathway cGAS-STING si attiva quando l'enzima cGAS rileva DNA citosolico e produce cGAMP (Cyclic guanosine monophosphate–adenosine monophosphate), che a sua volta attiva STING, innescando il segnale immunitario e la produzione di citochine [7]. Studi recenti hanno esplorato come il danno al DNA induca risposte immunitarie, in particolare tramite il pathway cGAS-STING, attivando risposte infiammatorie [7–9]. La proteina cGAS si trova principalmente nel citoplasma, ma recentemente è stato localizzata anche nel nucleo [10]. Tuttavia, i meccanismi che regolano il suo trasporto e la sua attività nel nucleo non sono ancora del tutto compresi e rimangono un argomento di grande interesse. D’altra parte, l’attivazione del sistema immunitario, sia innato che adattativo, è essenziale per riconoscere i patogeni e riparare i danni tissutali. L'interazione tra le radiazioni ionizzanti e il sistema immunitario è un campo interdisciplinare emergente noto come radioimmunobiologia. Nel contesto della biologia delle radiazioni, è stato dimostrato che le radiazioni a basse dosi (Low dose radiation, LDR) modulano le risposte immunitarie [11,12]. I meccanismi cellulari e molecolari delle risposte immunitarie indotte dalle radiazioni, soprattutto a basse dosi, non sono ancora ben compresi, rendendo questa un'area di ricerca attiva. I modelli tradizionali per spiegare gli effetti delle basse dosi sono piuttosto contraddittori, specialmente relativamente alla risposta immunitaria indotta. Un aspetto di particolare rilevanza è che la seconda parte di questo lavoro è stata svolta su cellule coltivate in un ambiente di BBR (Below Background Radiation), caratterizzato da condizioni di esposizione cronica e da dosi estremamente basse. In tale ambiente, infatti, non erano presenti radiazioni cosmiche, fotoni o neutroni, e l’unico contributo di radiazioni era costituito da raggi gamma, con un livello di esposizione pari a 27 nSv/h. È per questo che in questo studio sono state utilizzate cellule di cheratinociti umani immortalizzati (HaCaT) e gli esperimenti sono stati condotti: 1) in un ambiente naturale di radiazioni (Università RomaTre) e 2) presso i Laboratori nazionali del Gran Sasso (LNGS). LNGS, che, grazie alla loro posizione sotterranea, offrono un ambiente a bassa radiazione di fondo ambientale, riducendo le interferenze dai raggi cosmici e consentendo indagini accurate sugli effetti delle radiazioni a basse dosi [13,14]. L'esperimento “DISCOVER22” mira a determinare come gli ambienti a basso fondo naturale di radiazioni (Low environment radiation, LRE) influenzino le risposte immunitarie, esaminando in particolare l'attivazione della via cGAS-STING a seguito di danni al DNA indotti dalle radiazioni. Una parte di questo lavoro ha riguardato lo studio degli effetti delle radiazioni ionizzanti sul pathway cGAS-STING. Successivamente, l’attenzione si è concentrata sul comprendere come e se la quasi totale assenza del fondo naturale possa influenzare alcuni aspetti di questa risposta sistemica, a seguito di un insulto esterno rappresentato dall’esposizione a dosi di radiazioni ionizzanti. Sulla base di studi precedenti, sono stati effettuati esperimenti dose-dipendente (0.5, 1, 2 Gy) e tempo- dipendente di MNi totali e cGAS+ dopo raggi-X presso l’Università RomaTre, con l'obiettivo di esplorare la relazione tra il danno totale indotto delle radiazioni e la cinetica di attivazione di cGAS. I risultati indicano un aumento dose-dipendente dei MNi, come noto in letteratura, dopo l'esposizione ai raggi-X, e una significativa induzione di MNi cGAS+ dopo trattamento. Questi esperimenti hanno confermato che il numero di MNi totali ha raggiunto il picco a 24 h dopo l'irradiazione, ma il numero di MNi cGAS+ si mantiene costante nel tempo. Un aspetto interessante del lavoro è stato il ruolo dell'integrità dell'involucro nucleare (nuclear envelope, NE) nell'attivazione di cGAS. Lo studio ha rilevato che la maggior parte dei MNi cGAS+ ha perso l'integrità della lamina B1 dopo 24 h dall’uso di raggi-X, esponendo il DNA al citosol e consentendo il riconoscimento di cGAS. Questo risultato conferma l'ipotesi che la rottura dell'involucro nucleare sia un evento chiave, anche se non essenziale, nell'attivazione di cGAS. Inoltre, questo lavoro ha esaminato la relazione tra l'induzione di cGAS+ MNi e la risposta immunitaria innata misurando la produzione di interferoni di tipo I (IFN-α e β) e l'espressione della proteina ISG15, che sono cruciali nella segnalazione immunitaria innata. I dati hanno mostrato un aumento significativo degli interferoni e di ISG15 72-120 h dopo l'esposizione a 4 Gy di raggi-X, suggerendo che il danno al DNA indotto dalla radiazione porta all'attivazione immunitaria attraverso la via cGAS-STING. Negli esperimenti precedenti condotti nei laboratori RomaTre, è stato osservato che la percentuale di induzione di MNi cGAS+ era dell’11-15% sia nei campioni di controllo che in quelli irradiati. Sulla base di questi risultati, sono stati avviati esperimenti per determinare se, come suggerito nella letteratura [15,16], le radiazioni ionizzanti (Ionizing radiation, IR) non solo influenzano il MN totale ma anche il cGAS+ MN e quindi influiscono sul sistema immunitario attraverso la presenza di fattori inducibili. Il terreno proveniente da cellule irradiate è stato trasferito a cellule non trattate per verificare se inducesse MNi cGAS+. Sono state testate varie combinazioni di cellule irradiate e non irradiate. I risultati hanno mostrato un aumento statisticamente significativo dei MNi totali e dei MNi cGAS+ nei campioni che hanno ricevuto terreno condizionato. In particolare, anche il campione di controllo che ha ricevuto terreno irradiato ha mostrato un’induzione significativa di MNi cGAS+ su MNi totali, suggerendo una partecipazione dell’effetto Bystander. Ciò indica che cGAS potrebbe riconoscere il DNA libero attraverso un meccanismo che coinvolge fattori diffusibili rilasciati nel mezzo, meritando ulteriori indagini. In aggiunta, esperimenti condotti presso i Laboratori Nazionali del Gran Sasso (LNGS) in ambienti a radiazione ultra-bassa (LRE) e con un’esposizione cronica miravano a comprendere come la riduzione della radiazione di fondo naturale (Natural Background Radiation - NBR) influisca sulla risposta immunitaria. Le cellule sono state coltivate sia in condizioni di NBR che di BBR per un massimo di 60 giorni. I risultati hanno indicato che non ci sono differenze significative nella crescita cellulare. L'induzione di MNi totali dopo 1 Gy di raggi-X a diversi tempi di adattamento (20-40-60 giorni), non ha mostrato cambiamenti quando si confrontano le condizioni di radiazione di fondo (Natural Background Radiation - NBR) con quelle di radiazione di fondo (Below Background Radiation - BBR), ma è stata osservata una risposta ritardata nell'attivazione del cGAS al MN e di trasporto della proteina dal nucleo al citoplasma in condizioni di BBR, suggerendo che la radiazione di fondo influenzi i tempi della risposta immunitaria. In NBR, l’induzione di MNi cGAS+ ha raggiunto il picco a 48 h dall'esposizione, mentre in BBR il profilo di induzione era simile ma spostato di 48 h, indicando un’induzione ritardata di cGAS in BBR. Inoltre, l'induzione totale di MNi non ha correlato con l'induzione di cGAS, in quanto è rimasta invariata in entrambe le condizioni. Riassumendo, gli esperimenti hanno rivelato che i MNi cGAS+ raggiungevano picchi in tempi diversi a seconda dei diversi tempi di adattamento, con un ritardo in BBR rispetto a NBR. Questo ritardo non era attribuibile né al danno al DNA né a cambiamenti nei livelli di trascrizione di cGAS, ma probabilmente derivava da un trasporto nucleo-citosolico più lento della proteina cGAS in condizioni di BBR. Questo risultato evidenzia una potenziale differenza nei meccanismi di attivazione del cGAS tra i diversi ambienti di radiazione. A fronte di questo possibile trasporto ritardato, abbiamo voluto testare se anche l'attivazione del sistema immunitario innato fosse influenzata da questo. RT-qPCR per interferoni α e β e Western blot per l'espressione di ISG15 hanno rivelato l’attivazione immunitaria innata in entrambe le condizioni, con livelli più elevati di attivazione nel post-trattamento in BBR. In particolare ISG15, proteina stimolata dalla produzione diretta di interferoni, ha mostrato un aumento significativo anche a 168 h dopo 4 Gy in BBR rispetto a NBR, dove invece la sua espressione inizia a decrescere. Ciò indica che l'attività di ISG15 e cGAS può essere regolata da meccanismi più complessi, con le condizioni di BBR che influenzano il trasporto di cGAS e la tempistica della risposta immunitaria. In conclusione, la ricerca fornisce importanti spunti su come la radiazione influisca sul danno al DNA, sull'attivazione immunitaria e sul ruolo della radiazione di fondo nella modulazione di questi processi. Sottolinea la complessità dell'attivazione del cGAS e suggerisce che sono necessari ulteriori studi per comprendere appieno i meccanismi in gioco, in particolare in diversi ambienti di radiazione.