Eco-cyto-toxicological markers as early warning systems for marine and freshwater ecosystems' conservation and aquatic biodiversity sustainability

Pollution caused by Contaminants of Emerging Concern (CECs) represents one of the most pressing environmental challenges for marine coastal ecosystems. Among these pollutants, gadolinium (Gd) and microplastics (1 µm < MPs < 5 mm) have garnered significant attention due to their potential ecological and human health impacts. Gd, a lanthanide belonging to the rare earth elements (REEs) group, possesses unique physicochemical properties that make it indispensable in various technological and medical applications. Its use is particularly notable and extensively debated in the context of contrast agents for magnetic resonance imaging (MRI), as it can persist in the circulatory system and accumulate in various organs for over 40 days post-administration. MPs, ubiquitous in marine environments, consist of synthetic polymers within microscopic size ranges, originating either from the fragmentation of larger plastics (secondary MPs) or through intentional manufacture for specific applications (primary MPs). Due to their irregular and tridimensional surfaces, MPs can adsorb surrounding environmental pollutants, significantly enhancing their toxicity and hazard to marine biota. Both Gd and MPs are increasingly detected at elevated concentrations in freshwater and marine ecosystems, where they elicit various stress responses in aquatic organisms. Despite recent advancements in understanding the distribution and effects of these emerging contaminants, significant gaps persist in our knowledge of their bioaccumulation mechanisms, specific ecotoxicological impacts, and spatial variability across different compartments of marine coastal ecosystems. In response to these knowledge gaps, chapters I and II of this PhD thesis aimed to evaluate Gd and MPs contamination, respectively, within the Mediterranean Sea coasts. Sampling sites included coastal zones along the Tyrrhenian, Ionian, and Adriatic seas, providing a comprehensive overview of the distribution of these CECs along the Italian peninsula. In both cases, the bivalve mollusk Donax trunculus, commonly known as the wedge clam, was employed as a bioindicator. This species is widely recognized as a sentinel organism for sandy-bottom coastal environments and has been extensively used in monitoring emerging pollutants. Field sampling was complemented by size-based categorization of D. trunculus individuals into youngs (<1.5 cm shell length) and adults (>1.5 cm shell length) to assess potential size-dependent variations in contaminant accumulation. The second aim of the thesis, addressed in Chapters III and IV, focused on evaluating oxidative stress responses in D. trunculus following exposure to increasing concentrations of Gd, MPs (individually), and their mixtures. Recognizing that these contaminants often coexist in realistic conditions, laboratory experiments were designed to expose D. trunculus to increasing levels of Gd, MPs, and their combinations over 15 days. Biochemical analyses were conducted to assess parameters related to the metabolic activity (Electron Transport System, ETS; Glycogen Content, GLY; Protein Level, PROT), antioxidant defenses (Superoxide Dismutase, SOD; Glutathione Peroxidase, GPx; Total Antioxidant Capacity, TAC), biotransformation processes (Glutathione-S-Transferase, GSTs; Carboxylesterase, CbEs), cellular damage (Lipid Peroxidation, LPO), and neurotoxicity (Acetylcholinesterase, AChE). The findings from Chapters I and II revealed substantial geographical variability in Gd and MPs contamination along Mediterranean coasts. The Adriatic coast exhibited significantly higher contaminant levels compared to the Tyrrhenian coast, which was notably less impacted. This distribution likely reflects the influence of anthropogenic pressures, including industrial and urban discharges, population density, tourism activities, and region-specific hydrodynamic conditions and currents that facilitate the accumulation of these pollutants. D. trunculus proved to be an effective biomonitor, reflecting sediment contamination levels for both Gd and MPs and further affirming its value as a sentinel species in these ecosystems. Notably, young individuals accumulated significantly higher amounts of MPs than adults, potentially due to differences in filtration rates or metabolic activity. In contrast, Gd accumulation did not significantly differ between size classes, suggesting similar levels of exposure and uptake among smaller and larger individuals. In laboratory experiments, the results from Chapters III and IV demonstrated that D. trunculus exhibited a robust capacity for bioaccumulation of both Gd and MPs under controlled conditions, comparable or higher to other bivalve species reported in the literature. For the mixture condition (Gd + MPs), a lower concentration of Gd was detected in bivalve tissues, likely due to the adsorption of Gd onto MPs surfaces, which reduced its bioavailability. Biochemical analyses revealed contaminant-specific oxidative stress responses, with predominantly inhibitory effects observed following MPs exposure, whereas Gd exposure resulted in elevated levels of oxidative stress markers. In mixture conditions, MPs acted as carriers, amplifying the oxidative stress induced by Gd. The time factor was also critical, with more severe stress responses recorded at the end of the experiment (day 15) compared to earlier stages (day 7). In conclusion, this PhD thesis advances the understanding of the significance of monitoring emerging contaminants, such as Gd and MPs, in marine coastal ecosystems. The results underscore the ecological relevance of D. trunculus in biomonitoring programs. Specifically, the species’ high bioaccumulation capacity, both in situ and in laboratory conditions, combined with its contaminant-specific oxidative stress responses, highlights its potential as a valuable tool for assessing the impacts of emerging pollutants in marine environments.

L'inquinamento causato dai contaminanti di interesse emergente (Contaminants of Emerging Concern, CECs) rappresenta una delle maggiori sfide ambientali per gli ecosistemi marino costieri. Tra questi inquinanti, il gadolinio (Gd) e le microplastiche (1 µm < MPs < 5 mm), hanno suscitato particolare attenzione a causa dei loro potenziali impatti ecologici e sulla salute umana. Il Gd, è un elemento della tavola periodica appartenente al gruppo delle terre rare (REEs). Grazie alla sua natura metallica e alle sue proprietà fisico-chimiche, trova numerose applicazioni in ambito tecnologico e medico. L'uso del Gd è particolarmente rilevante e discusso nel contesto del suo impiego come mezzo di contrasto per la risonanza magnetica (MRI), poiché, una volta somministrato ai pazienti, può rimanere in circolo e accumularsi in diversi organi per un periodo superiore ai 40 giorni. Le MPs, ubiquitarie negli ambienti marini, includono polimeri sintetici di dimensioni microscopiche derivanti dalla frammentazione di plastiche di maggiori dimensioni (MPs di origine secondaria) o realizzati appositamente di tale dimensione per applicazioni specifiche (MPs di origine primaria). Grazie alle loro superfici spesso irregolari e tridimensionali, le MPs adsorbono contaminanti ambientali circostanti, diventando ancora più pericolose e tossiche per il biota marino. Entrambi i contaminanti, Gd e MPs, sono riscontrati a concentrazioni sempre più elevate negli ecosistemi acquatici dulcacquicoli e marini, dove inducono diverse risposte di stress negli organismi marini. Tuttavia, nonostante i progressi nella comprensione della distribuzione e degli effetti di questi contaminanti emergenti, rimangono significative lacune conoscitive riguardo ai meccanismi di bioaccumulo, agli effetti ecotossicologici specifici e alla loro distribuzione spaziale nei diversi comparti degli ecosistemi marino costieri. Da queste premesse, il I e il II capitolo della presente tesi di dottorato hanno l’obiettivo di valutare la contaminazione da Gd e MPs, rispettivamente, nel contesto del Mediterraneo, includendo siti di campionamento lungo i versanti costieri tirrenico, ionico e adriatico. Questo approccio ha fornito una visione complessiva della distribuzione dei CECs di interesse lungo la penisola italiana. In entrambe le analisi, il mollusco bivalve Donax trunculus, comunemente noto come arsella o tellina, è stato utilizzato come bioindicatore della contaminazione di entrambi i contaminanti indagati. La specie D. trunculus è considerata una sentinella di allarme precoce promettente per il monitoraggio dell'inquinamento negli ambienti marino costieri con fondale sabbioso, e utilizzata ampiamente in diversi studi di monitoraggio di contaminanti emergenti. Le analisi in campo sono state realizzate includendo un ulteriore step, dividendo gli individui di D. trunculus in due classi di taglia: giovani (<1,5 cm di lunghezza del guscio) e adulti (>1,5 cm di lunghezza del guscio). Il secondo obiettivo di questo studio, su cui si sviluppano i capitoli III e IV della presente tesi, è stato quello di valutare le risposte di stress ossidativo in seguito all'esposizione di concentrazioni crescenti di Gd, MPs presi singolarmente e concentrazioni risultanti dalle loro combinazioni, dal momento che in condizioni realistiche ambientali questi due contaminanti coesistono a concentrazioni più o meno elevate. Gli esperimenti di laboratorio hanno previsto l’esposizione di D. trunculus a concentrazioni crescenti di Gd e Mps e i loro mix, per un totale di 15 giorni, e le risposte di stress ossidativo hanno previsto l’analisi dei parametri biochimici coinvolti nell’attività metabolica (Sistema di trasporto delgli elettroni, ETS; contenuto di glicogeno, GLY; livello delle proteine, PROT), degli enzimi antiossidanti (Superossido dismutasi, SOD; Glutatione perossidasi, GPx; capacità totale antiossidante TAC) e di biotrasformazione (Glutations-S-Transferasi, GSTs; Carboxil-Esterasi, CbEs), il danno cellulare (Perossidazione lipidica, LPO) e la neurotossicità (Acetil-colin-Esterasi, AChE). I risultati dei del I e del II capitolo della tesi hanno evidenziato una significativa variabilità geografica della contaminazione di Gd e MPs lungo le coste del Mediterraneo, con livelli più elevati dei contaminanti studiati osservati lungo la costa adriatica, mentre il versante tirrenico, a confronto, è risultato notevolmente meno inquinato sia per Gd che per le MPs. Tale distribuzione riflette probabilmente l'influenza di fattori antropogenici, tra cui la presenza di scarichi industriali e urbani, l’alta densità di popolazione e l’elevato turismo, nonché le condizioni idrodinamiche regionali e le correnti marine con la formazione di zone di accumulo dei contaminanti studiati. D. trunculus ha mostrato di essere un ottimo biomodello, riflettendo la contaminazione di Gd e MPs della matrice del sedimento, sottolineando ulteriormente la sua utilità come specie sentinella per questi ambienti. Inoltre gli individui giovani hanno accumulato significativamente più MPs rispetto agli adulti, probabilmente a causa di differenze nei tassi di filtrazione o nell’attività metabolica. Per quanto riguarda il Gd, non sono state osservate differenze significative tra le due classi di taglia, suggerendo che anche in questo caso gli individui più piccoli hanno presentato livelli elevati dei contaminanti nei propri tessuti, paragonabili a quelli degli individui di dimensioni maggiori. Per quanto riguarda gli esperimenti indoor, i risultati del III e del IV capitolo hanno rivelato che anche in condizioni controllate D. trunculus presenta una buona capacità di bioaccumulo sia per il Gd che per le MPs, paragonabile o superiore alle altre specie di bivalvi studiati in letteratura. Per la condizione del mix (Gd + MPs), è stata ritrovata una quantità minore di Gd nei tessuti del bivalve alla fine dell’esperimento, suggerendo che le MPs presenti nell’acquario abbiano interagito con il Gd presente, adsorbendolo sulla propria superficie, e rendendolo meno disponibile per i bivalvi. Per quanto riguarda i parametri biochimici, le risposte di stress ossidativo di D. trunculus sono state specifiche nei confronti dei contaminanti indagati, con risposte per lo più inibitorie in seguito all’esposizione delle MPs, mentre risposte con livelli elevati dei parametri biochimici analizzati sono state osservate per il Gd. Nelle esposizioni di mix, le MPs hanno agito da carriers, potenziando la risposta di stress ossidativo causata dal Gd. Anche il fattore tempo è stato importante, apportando risposte più severe di stress nei campioni raccolti alla fine dell’esperimento (seconda settimana), rispetto ai campioni raccolti alla fine della prima settimana. In conclusione, il presente lavoro di tesi contribuisce ad approfondire l'importanza del monitoraggio dei contaminanti emergenti, Gd e MPs, negli ambienti marino costieri. I risultati ottenuti sottolineano il ruolo ecologico cruciale della specie D. trunculus nei programmi di biomonitoraggio. In particolare, l’elevata capacità di bioaccumulo dimostrata da questa specie, sia in condizioni naturali che negli esperimenti indoor, insieme alle risposte specifiche di stress ossidativo osservate, ne evidenziano il potenziale come strumento prezioso per la valutazione degli impatti derivanti dai contaminanti emergenti che caratterizzano gli ecosistemi marini.