Study of adaptive immune responses induced by viruses in multiple sclerosis

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease that can lead to progressive disability over time. The etiology of the disease remains unknown, although genetic predisposition and environmental factors have been associated with its onset. Viral infections play a crucial role in the development of several autoimmune diseases, and MS is no exception. A pro-inflammatory environment generated by virus-specific T cells can activate autoreactive T cells through TCR-independent mechanisms. These indirectly activated (bystander) T cells—i.e., cells activated by the cytokine/inflammatory milieu generated by the antiviral response in the absence of direct antigen recognition—have so far not been extensively characterized, and understanding their role in the pathogenesis of autoimmune diseases is of fundamental importance. The main objective of this project was to obtain a comprehensive phenotypic and transcriptomic portrait of bystander T cells. An in vitro system was established to model an antiviral immune response by stimulating PBMCs with pools of viral peptides and analyzing them using high-dimensional flow cytometry. This approach made it possible to distinguish antigen-specific T cells from indirectly activated (bystander) cells by exploiting a classic principle of T-cell immunology: cognate peptide–MHC recognition induces rapid down-modulation of the TCR/CD3 complex (internalization/down-modulation), a phenomenon linked to “serial triggering” of TCRs. Accordingly, T cells directly recognizing antigen were identified as CD3 low, whereas cells activated predominantly by the inflammatory/cytokine milieu retained high CD3 expression (CD3 high). To reproducibly generate a condition of bystander activation, PBMCs were also stimulated with a cytokine cocktail defined on the basis of mediators present in the supernatants of peptide-stimulated cultures. This resulted in robust activation in the absence of antigen-specific stimulation and with maintenance of high CD3 expression (CD3 high), consistent with the definition of bystander activation as antigen-independent activation. The main subpopulations (CD3 low antigen-specific T cells; CD3 high bystander T cells; and a CD69+ activated fraction within the CD3 high population) were then purified by cell sorting. A fraction of the cells was subjected to single-cell RNA sequencing integrated with V(D)J/TCR sequencing, while another fraction was cultured to establish lines and clones and to reassess their functional properties, including cytokine production and proliferative capacity, in response to both viral peptide pools and clonal/polyclonal stimuli. Although our results did not show an increased frequency of bystander T cells in patients with MS compared with healthy donors, bystander T cells expressed higher levels of CCR6, a marker associated with pathogenic Th17 and Th1-17 cells and with infiltration into the central nervous system (CNS). In contrast, antigen-specific CD4+ T cells were mainly characterized by expression of CD137. Consistent with a pro-inflammatory phenotype, in vitro experiments demonstrated that bystander T cells produce a combination of cytokines associated with Th17 and Th1-17 profiles, including IFN-γ, IL-17, and IL-22, following stimulation with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin, whereas antigen-specific T cells predominantly produce IFN-γ. In addition, bystander and CD69+ T cells displayed a reduced proliferative capacity compared with antigen-specific T cells in response to stimulation with viral peptide pools. Single-cell transcriptomic analysis identified two clusters (clusters 0 and 7) enriched in cytokine-stimulated samples and in bystander samples. These clusters are characterized by high expression of inflammation-associated genes, including ltb, il32, ccr2, ccr6, il22, and tnfsf13b (BAFF), consistent with an activated Th17-like phenotype. Notably, cluster 7 was exclusive to purified bystander T cells from both healthy donors and patients with MS and was characterized by the expression of interferon-stimulated genes (IFIT), indicative of a strong antiviral response. Analysis of the TCR repertoire further revealed a higher frequency of connected CDR3 clonotypes in patients with MS compared with healthy donors, suggesting greater antigen recognition potential. Moreover, T cells from people with MS (pwMS) contained clonotypes previously identified in brain tissue and peripheral blood of pwMS under all stimulation conditions. Clonotypes specific for peripheral myelin protein 22 (PMP-22)—an autoantigen involved in experimental autoimmune neuritis and Guillain–Barré syndrome—or for myelin basic protein (MBP) were shared by two and one patients with MS in our cohort, respectively. In conclusion, our results indicate that T lymphocytes which, following stimulation with viral peptides, upregulate activation markers while maintaining high CD3 expression and lacking the canonical signature of antigen recognition represent a likely bystander population. This population is enriched in cells with a strongly pro-inflammatory profile and marked tissue-migratory capacity and is concentrated in specific transcriptional clusters characterized by expression of inflammatory mediators and molecules that support activation and recruitment of other immune cells. From an immunological perspective, the most relevant finding is that these cells should not be interpreted merely as transient effectors of inflammation, but rather as potential promoters of meningeal microenvironments conducive to the organization of tertiary lymphoid tissue. In this way, they may contribute to the long-term maintenance of permissive conditions for the expansion and selection of autoreactive responses within the central nervous system, providing a unifying framework linking infection-triggered activation, persistence of inflammation, and disease chronicity.

La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica che può portare a una disabilità progressiva nel tempo. L’eziologia della malattia rimane sconosciuta, sebbene una predisposizione genetica e fattori ambientali siano stati associati alla sua insorgenza. Le infezioni virali svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo di diverse malattie autoimmuni e la SM non fa eccezione. Un ambiente pro-infiammatorio generato da cellule T virus-specifiche può attivare cellule T autoreattive attraverso meccanismi indipendenti dal TCR. Queste cellule T attivate indirettamente (bystander), cioè attivate dall’ambiente citochinico/infiammatorio generato dalla risposta antivirale e in assenza di riconoscimento diretto dell’antigene non sono state finora ampiamente caratterizzate, e comprendere il loro ruolo nella patogenesi delle malattie autoimmuni è di fondamentale importanza. L’obiettivo principale di questo progetto è stato quello di ottenere un ritratto fenotipico e trascrittomico completo delle cellule T bystander. È stato messo a punto un sistema in vitro per modellare una risposta immunitaria antivirale, stimolando PBMC con pool di peptidi virali e analizzandole mediante citometria a flusso ad alta dimensionalità. Questo approccio ha permesso di separare le cellule T antigene-specifiche da quelle attivate indirettamente (bystander), sfruttando un principio classico dell’immunologia T: il riconoscimento cognato peptide–MHC induce una rapida modulazione verso il basso del complesso TCR/CD3 (internalizzazione/down-modulation), fenomeno legato al “serial triggering” dei TCR. Pertanto, le cellule T che riconoscono direttamente l’antigene sono state identificate come CD3 low, mentre le cellule che si attivano prevalentemente per effetto del milieu infiammatorio/citochinico mantengono un’espressione CD3 high. Per ricreare in modo controllato una condizione di attivazione bystander, sono state inoltre stimolate PBMC con un cocktail di citochine definito sulla base dei mediatori presenti nei surnatanti delle colture peptide-stimolate, ottenendo un’attivazione robusta in assenza di stimolo antigene-specifico e con mantenimento di CD3 ad alti livelli (CD3 high), coerentemente con la definizione di bystander activation come attivazione non guidata dal riconoscimento dell’antigene. Le principali sottopopolazioni (cellule T CD3 low antigene-specifiche; cellule T CD3 high bystander; e una frazione CD69+ attivata all’interno delle CD3high) sono state quindi purificate mediante sorting. Una quota è stata destinata a single-cell RNA-seq integrata con sequenziamento V(D)J/TCR, 2 mentre un’altra quota è stata messa in coltura per stabilire linee e cloni e riesaminarne le proprietà funzionali, inclusa la produzione di citochine e la capacità proliferativa, in risposta sia a pool peptidici virali sia a stimoli clonali/policlonali. Sebbene i nostri risultati non abbiano mostrato una maggiore frequenza di cellule T bystander nei pazienti con SM rispetto ai controlli sani, le cellule T bystander hanno espresso livelli più elevati di CCR6, un marcatore associato alle cellule Th17 e Th1-17 patogeniche e all’infiltrazione nel sistema nervoso centrale (SNC). Al contrario, le cellule T CD4+ antigen-specifiche sono risultate principalmente caratterizzate dall’espressione di CD137. In linea con un fenotipo pro-infiammatorio, gli esperimenti in vitro hanno dimostrato che le cellule T bystander producono una combinazione di citochine associate ai profili Th17 e Th1-17, tra cui IFN-γ, IL-17 e IL-22, dopo stimolazione con phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) e ionomicina, mentre le cellule T antigene-specifiche producono prevalentemente IFN-γ. Inoltre, le cellule T bystander e CD69+ hanno mostrato una capacità proliferativa ridotta rispetto alle cellule T antigene-specifiche in risposta alla stimolazione con pool di peptidi virali. L’analisi trascrittomica a singola cellula ha identificato due cluster (cluster 0 e 7) arricchiti nei campioni stimolati con citochine e nei campioni bystander. Tali cluster sono caratterizzati da un’elevata espressione di geni associati all’infiammazione, tra cui ltb, il32, ccr2, ccr6, il22 e tnfsf13b (BAFF), coerente con un fenotipo Th17-like attivato. In particolare, il cluster 7 è risultato esclusivo delle cellule T bystander purificate sia da HD sia da pazienti con SM ed è caratterizzato dall’espressione di geni stimolati dall’interferone (IFIT), indicativi di una forte risposta antivirale. L’analisi del repertorio del TCR ha inoltre evidenziato una maggiore frequenza di clonotipi CDR3 connessi nei pazienti con SM rispetto agli HD, suggerendo una maggiore capacità di riconoscimento antigenico. Inoltre, le cellule T provenienti da persone con SM (pwMS) contenevano clonotipi precedentemente identificati nel tessuto cerebrale e nel sangue periferico di pwMS in tutte le condizioni di stimolazione. Clonotipi specifici per la peripheral myelin protein 22 (PMP-22) un autoantigene coinvolto nella neurite autoimmune sperimentale e nella sindrome di Guillain–Barré—o per la myelin basic protein (MBP) erano condivisi rispettivamente da due e da un paziente con SM della nostra coorte. In conclusione, i nostri risultati indicano che i linfociti T che, dopo stimolazione con peptidi virali, aumentano i marker di attivazione pur mantenendo elevata l’espressione di CD3 e senza la firma canonica del riconoscimento antigenico rappresentano una popolazione verosimilmente bystander. 3 Questa popolazione è arricchita in cellule con un profilo nettamente proinfiammatorio e con marcate capacità di migrare nei tessuti, e si concentra in specifici cluster trascrizionali caratterizzati dall’espressione di mediatori infiammatori e di molecole che sostengono l’attivazione e il reclutamento di altre cellule immuni. Dal punto di vista immunologico, il dato più rilevante è che queste cellule non vanno interpretate solo come effettrici transitorie dell’infiammazione, ma come potenziali promotrici di microambienti meningei favorevoli all’organizzazione di tessuto linfoide terziario. In questo modo possono contribuire a mantenere nel tempo condizioni permissive per l’espansione e la selezione di risposte autoreattive nel sistema nervoso centrale, offrendo una chiave di lettura unificante tra attivazione innescata da stimoli infettivi, persistenza dell’infiammazione e cronicizzazione della malattia.