BEETLE-DERIVED CANTHARIDIN AND ITS DERIVATIVES AS POTENTIAL THERAPEUTIC AGENTS FOR THE TREATMENT OF SOLID TUMOURS: DESIGN AND DEVELOPMENT OF ANTIBODY-DRUG CONJUGATES

Historically, natural products have served as a cornerstone of therapeutic innovation, with around half of all current clinical drugs originating from natural sources. One such example is cantharidin (CTD), a terpenoid toxin produced by blister beetles of the Meloidae family. It demonstrates how ancient remedies can inspire modern cancer therapy. Used in traditional Chinese medicine for over two millennia to treat various ailments, CTD has only recently gained scientific attention for its potent anti-cancer properties. However, the clinical application of CTD has been severely hindered by dose-limiting toxicities, particularly nephrotoxicity, gastrointestinal distress and systemic adverse effects, which occur even at therapeutic doses. To address these limitations, norcantharidin (NCTD), the demethylated synthetic analogue of CTD, was developed and has been used in China since 1984 to treat cancer. While NCTD retains the anticancer efficacy of its parent compound, it exhibits significantly reduced nephrotoxicity and systemic toxicity, making it a more clinically viable candidate. Both molecules primarily act by inhibiting protein phosphatases PP1 and PP2A, which are critical enzymes that regulate cell cycle progression, apoptosis, and DNA repair mechanisms. PP2A is a key enzyme involved in regulating essential cellular processes, such as the cell cycle, apoptosis and cell-fate determination. Alteration of this enzyme impacts multiple downstream signaling pathways involved in cell cycle regulation, stress responses, and the initiation of apoptotic mechanisms. Despite these promising characteristics, the precise molecular mechanisms underlying the cytotoxic actions of both compounds, their differential effects on tumour versus normal cells, and optimal strategies to enhance their therapeutic selectivity, still need to be fully understood, forming the basis of this comprehensive investigation. The primary objectives of this research were multifaceted and are as follows: 1) to systematically characterize the cytotoxic effects of CTD and NCTD across multiple solid tumour types, including gliomas, melanomas and squamous cell carcinomas, alongside their normal cellular counterparts. 2) to elucidate the molecular mechanisms driving their anti-cancer activity with particular emphasis on oxidative stress pathways, calcium homeostasis and antioxidant defense systems. 3) to identify and validate tumour-selective surface markers suitable for targeted drug delivery 4) to design and develop an antibody-drug conjugate capable of achieving tumour-selective delivery of one of the two molecules while minimizing off-target toxicity. The preliminary screening for cytotoxicity revealed complex and cell-type-specific responses to both compounds. CTD showed dose-dependent cytotoxicity across all tested cell lines. In glioma cells, the half-maximal inhibitory concentration (IC50) was approximately 10 µM after 24 hours of treatment, while in normal human astrocytes the IC50 value was 5 µM. Long-term exposure studies extending up to 192 hours demonstrated that the cytotoxic effects persist over time, increasing in a dose- and time-dependent manner. In melanoma cell lines, significant toxicity was observed at a concentration as low as 5 µM CTD, whereas normal human melanocytes (NHM) exhibited notably milder responses, requiring substantially higher concentrations to achieve a comparable rate of cell death. This differential toxicity profile suggests a potential therapeutic window for the treatment of melanoma. Squamous cell carcinoma cells proved remarkably resistant, with IC50 values ranging from 25 to 50 µM, indicating that sensitivity varies significantly across different cancer types. Findings relating to NCTD provide important insights into the assessment of a therapeutic window for melanomas, which exhibit a significant response to concentrations ranging from 12,5 to 25 µM. In contrast, normal cells show minimal toxicity even at 100 µM. This remarkable differential toxicity profile of NCTD immediately positioned it as a more promising candidate for clinical development, particularly for melanoma therapy. To understand how these molecules access their intracellular targets, membrane permeability studies were conducted utilizing the Parallel Artificial Membrane Permeability Assay (PAMPA). Both CTD and NCTD exhibited robust passive membrane permeability. It should be noted that NCTD permeability was particularly high, being comparable to that of caffeine, a well-known high-permeability compound. Following internalization within the cells, both compounds triggered a cascade of molecular events that were systematically dissected. Flow cytometric analysis revealed a rapid production of reactive oxygen species (ROS) following treatment of glioma cells (U373) with CTD, reaching a peak at 6 hours, followed by gradual decline. Conversely, melanoma cells showed a distinct pattern: ROS levels increased after 6 hours and remained persistently elevated for up to 24 hours, reaching levels 4- to 6-fold higher than the control group. Importantly, normal melanocytes exhibited only a transient ROS peak, fully recovering to baseline levels within 24 hours. The same effects were obtained following NCTD treatment. Notably, NHM showed that even at elevated NCTD concentrations, ROS levels were restored after 24 hours. Upon examining the activation of the antioxidant response, a notable characteristic of CTD and NCTD was revealed: a potent inhibition of Nrf2, the primary transcriptional regulator of the cellular antioxidant response. Western blot analysis revealed dramatic reductions in nuclear Nrf2 levels following treatment, with a 50% reduction observed at 2 hours progressing to 60-65% by 24 hours. Note that Nrf2 mRNA levels remained unchanged with CTD treatment, suggesting that the inhibition occurs at the post-translational level, affecting protein localization rather than synthesis. Most remarkably, CTD prevented Nrf2 nuclear accumulation even in the presence of dimethyl fumarate, a potent Nrf2 activator which works by releasing Nrf2 from its negative regulator, KEAP1. This finding indicates that CTD may block a step downstream of Nrf2 stabilization, potentially by interfering with the nuclear import machinery or promoting the rapid export of Nrf2 from the nucleus. By disarming the master regulator of antioxidant defenses prior to inducing oxidative stress, these compounds effectively render the cell impervious to incoming damage. The consequences of Nrf2 inhibition were evident in our analysis of antioxidant gene expression. Rather than a coordinated response, marked heterogeneity was observed: catalase mRNA decreased steadily whereas the expression of the cystine transporter xCT and the heme oxygenase-1 (HO-1) increased substantially. At the protein level, xCT increased modestly while HO-1 showed a substantial increase. However, there was a significant decrease in glutathione peroxidase 4 (GPX4) levels. Treating cells with N-acetylcysteine (NAC), a potent ROS scavenger, xCT and HO-1 levels were fully restored to baseline values, thus suggesting that their induction was a direct response to the increase in ROS rather than being Nrf2-mediated transcription. Given the elevated level of ROS production, it was hypothesized that oxidative stress might be the primary mechanism of cell death. To test this, NAC was used, resulting in complete restoration of ROS levels to baseline at all analysed time points. However, this complete neutralization only resulted in a modest 10% improvement in cell viability, thereby demonstrating that although ROS production was caused by the treatment, oxidative stress was not the main executor of cell death. This unanticipated outcome prompted further investigation into alternative mechanisms. Real-time calcium imaging revealed an additional critical mechanism: both compounds induced a progressive increase in cytosolic calcium concentration, which began approximately 170 minutes after treatment and persisted throughout all examined time windows. This fundamental observation was derived from experiments conducted with extracellular calcium chelators and channel blockers, which were unsuccessful in preventing calcium accumulation. This suggests that calcium originates from intracellular stores, most likely the endoplasmic reticulum, rather than from extracellular space. After studying the cytotoxicity properties of NCTD and identifying a potential upper therapeutic window in melanomas, the focus shifted to developing a targeted delivery strategy to further increase tumour selectivity. A systematic evaluation of potential tumour markers was conducted, encompassing System Xc-, CD44 and its variant isoforms, and members of the epidermal growth factor receptor (EGFR) family, such as HER1, HER2, HER3. Expression profiles revealed significant differences between tumour types: glioma cells predominantly expressed HER1, with lower levels of HER2 and HER3; meanwhile melanoma cells exhibit minimal HER1 expression, alongside high levels of HER2 and HER3. Initially, it was hypothesized that there would be potential toxicity issues because normal melanocytes express high levels of HER3. However, normal keratinocytes, which surround melanocytes in the skin, exhibit minimal HER3 expression, with only 4.5% of cells being positive for the marker. This suggests that an antibody conjugate directed against HER3 could be more selective for melanoma, while sparing the surrounding normal tissue, due to the inherent resistance of melanocytes to NCTD. Thus, an antibody conjugated with NCTD (ADC) targeting HER3 in a DAR4 configuration (i.e., with four drug molecules linked to each antibody) was developed. The NCTD was conjugated via a linker designed to release the payload into the lysosomal environment following receptor-mediated endocytosis. Internalization studies confirmed that both the unconjugated antibody and the ADC are efficiently internalized by melanoma cells. This validates the uptake mechanism required for drug delivery. Preliminary cytotoxicity studies provided proof-of-concept for selective tumour elimination. At an ADC concentration of 60 µM, melanoma cells exhibited a 24% reduction in viability after 72 hours, while HER3-negative keratinocytes showed no change. CTD and NCTD have been observed to induce cell death in both tumour types. It is important to note that these agents impede Nrf2 nuclear translocation, resulting in the deactivation of antioxidant defenses and interference with various cellular processes. Cytotoxicity may result from calcium homeostasis and endoplasmic reticulum impairment, and Nrf2 deactivation, with ROS production acting as a secondary inducer of death. In conclusion, NCTD is the most promising candidate for the development of an ADC directed against HER3. It is selectively toxic to melanoma cells while sparing keratinocytes, providing a solid basis for precision anti-tumour strategies.

I prodotti naturali hanno storicamente rappresentato un pilastro dell’innovazione terapeutica, con circa la metà dei farmaci attualmente in uso clinico derivati da fonti naturali. Tra questi, la cantaridina (CTD), una tossina terpenoide prodotta dai coleotteri vescicanti della famiglia Meloidae, rappresenta un esempio affascinante di come rimedi antichi possano ispirare la moderna terapia antitumorale. Utilizzata per oltre due millenni nella medicina tradizionale cinese per il trattamento di diverse patologie, la cantaridina ha acquisito solo recentemente attenzione scientifica per le sue potenti proprietà antitumorali. Tuttavia, l’applicazione clinica della cantaridina è stata fortemente limitata da tossicità dose-limitanti, in particolare nefrotossicità, disturbi gastrointestinali ed effetti avversi sistemici che si manifestano anche a dosi terapeutiche. Per superare tali limitazioni è stata sviluppata la norcantaridina (NCTD), analogo sintetico demetilato della cantaridina, utilizzata in Cina dal 1984 per il trattamento dei tumori. Sebbene la norcantaridina mantenga l’efficacia antitumorale del composto parentale, essa mostra una nefrotossicità e una tossicità sistemica significativamente ridotte, rendendola un candidato clinicamente più praticabile. Queste molecole agiscono principalmente inibendo le fosfatasi proteiche PP1 e PP2A, enzimi critici che regolano la progressione del ciclo cellulare, l’apoptosi e i meccanismi di riparazione del DNA. PP2A è un enzima chiave nel controllo di processi cellulari fondamentali quali il ciclo cellulare, l’apoptosi e la determinazione del destino cellulare. Questa alterazione influenza molteplici vie di segnalazione a valle coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare, nelle risposte allo stress e nell’attivazione dei meccanismi apoptotici. Nonostante queste caratteristiche promettenti, i meccanismi molecolari precisi alla base dell’azione citotossica di entrambi i composti, i loro effetti differenziali su cellule tumorali rispetto a cellule normali e le strategie ottimali per aumentarne la selettività terapeutica sono rimasti non completamente chiariti e costituiscono il razionale di questo progetto di ricerca. Gli obiettivi principali di questa ricerca sono stati molteplici e sono elencati di seguito: 1) caratterizzare sistematicamente gli effetti citotossici della cantaridina e della norcantaridina in diversi tipi di tumori solidi, inclusi gliomi, melanomi e carcinomi squamosi, insieme alle rispettive controparti cellulari normali; 2) chiarire i meccanismi molecolari responsabili della loro attività antitumorale, con particolare attenzione allo stress ossidativo, all’omeostasi del calcio e ai sistemi di difesa antiossidante; 3) identificare e validare marcatori di superficie tumorali il più possibile selettivi e idonei al drug delivery; 4) progettare e sviluppare un anticorpo coniugato (antibody–drug conjugate, ADC) per un futuro approccio terapeutico che renda la somministrazione della cantaridina/norcantaridina più selettiva verso il tumore minimizzando la tossicità off-target. Lo screening iniziale di citotossicità ha rivelato risposte, ad entrambi i composti, complesse e specifiche per tipo cellulare. La cantaridina ha mostrato una citotossicità dose-dipendente in tutte le linee cellulari testate, con concentrazioni inibitorie (IC50) di circa 10 µM nelle cellule di glioma dopo 24 ore di trattamento e di 5 µM negli astrociti umani normali. Studi di esposizione a lungo termine, fino a 192 ore, hanno dimostrato che gli effetti citotossici persistono nel tempo, con un aumento della tossicità sia dose- che tempo-dipendente. Nelle linee cellulari di melanoma, una tossicità significativa è stata osservata a partire da 5 µM di cantaridina, mentre i melanociti normali hanno mostrato effetti nettamente più lievi, essendo necessarie concentrazioni sostanzialmente più elevate per ottenere una percentuale di morte cellulare comparabile. Questo profilo di tossicità differenziale suggeriva l’esistenza di una finestra terapeutica sfruttabile per il trattamento del melanoma. Le cellule di carcinoma squamoso si sono dimostrate particolarmente resistenti, con valori di IC50 compresi tra 25 e 50 µM, indicando una sensibilità eterogenea tra i diversi tipi di tumore. La norcantaridina ha fornito uno dei primi risultati chiave nell’identificazione di una finestra terapeutica per il trattamento dei melanomi. Infatti, nei melanociti normali è stata osservata una tossicità minima anche a dosi molto elevate come 100 µM, mentre le cellule di melanoma hanno mostrato elevata mortalità alle dosi più basse nell’intervallo 2,5–25 µM. Questa marcata tossicità differenziale ha immediatamente posizionato la norcantaridina come il candidato più promettente per lo sviluppo clinico, in particolare in prospettiva per la terapia del melanoma. Per comprendere come queste molecole raggiungano i loro bersagli intracellulari, sono stati condotti studi di permeabilità di membrana mediante il Parallel Artificial Membrane Permeability Assay (PAMPA). Sia la cantaridina sia la norcantaridina hanno mostrato una robusta permeabilità passiva di membrana, con la norcantaridina che ha evidenziato una permeabilità particolarmente elevata, paragonabile a quella della caffeina, un composto noto per l’elevata permeabilità. Una volta all’interno delle cellule, entrambi i composti hanno innescato una cascata di eventi molecolari che è stata analizzata in modo sistematico. L’analisi mediante citofluorimetria ha rivelato una rapida produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) in seguito al trattamento con la cantaridina. In particolare, nelle cellule di glioma è stato osservato un picco di ROS dopo 6 ore di trattamento, seguito da un graduale declino. Nelle cellule di melanoma è stato osservato un andamento diverso in cui livelli di ROS, in aumento dopo 6 ore e persistentemente elevati fino a 24 ore, hanno raggiunto valori 4–6 volte superiori al controllo. Al contrario, i melanociti normali hanno mostrato solo un picco transitorio di ROS, con un completo ritorno ai livelli basali entro 24 ore. Effetti analoghi sono stati osservati anche dopo trattamento con NCTD. In particolare, i melanociti umani normali hanno dimostrato che, anche se esposti a concentrazioni molto più elevate di NCTD, i livelli di ROS venivano ripristinati dopo 24 ore. Analizzando l’attivazione della risposta antiossidante, è stata individuata una delle caratteristiche più sorprendenti dell’azione di cantaridina e norcantaridina, ovvero, una potente inibizione di Nrf2, il principale regolatore trascrizionale della risposta antiossidante cellulare. L’analisi mediante western blot ha rivelato una drastica riduzione dei livelli nucleari di Nrf2 dopo il trattamento, con una diminuzione del 50% a 2 ore che progrediva fino al 60–65% a 24 ore. È importante sottolineare che i livelli di mRNA di NRF2 rimanevano invariati dopo trattamento con CTD, indicando che l’inibizione avviene a livello post-traduzionale, influenzando la localizzazione proteica piuttosto che la sintesi. In modo particolarmente rilevante, la cantaridina ha impedito l’accumulo nucleare di Nrf2 anche in presenza di dimetil fumarato, un potente attivatore di Nrf2 che agisce liberando Nrf2 dal suo regolatore negativo KEAP1. Questo risultato indica che la cantaridina blocca una fase a valle della stabilizzazione di Nrf2, probabilmente interferendo con i meccanismi di importazione nucleare o promuovendo una rapida esportazione nucleare. Disattivando il principale regolatore delle difese antiossidanti, questi composti impediscono alla cellula di contrastare lo stress ossidativo rendendola di fatto “cieca” al danno imminente. Le conseguenze dell’inibizione di Nrf2 sono risultate evidenti nell’analisi dell’espressione dei geni antiossidanti. Invece di una risposta coordinata, è stata osservata una marcata eterogeneità: l’mRNA della catalasi diminuiva costantemente, mentre il trasportatore della cistina xCT e l’eme ossigenasi-1 (HO-1) mostravano una forte induzione. A livello proteico, xCT aumentava in modo modesto, mentre HO-1 mostrava un incremento sostanziale. Tuttavia, i livelli di glutatione perossidasi 4 (GPX4) diminuivano in modo significativo. Il trattamento delle cellule con N-acetilcisteina, in grado di neutralizzare l’aumento di ROS, ha riportato i livelli di xCT e HO-1 ai valori basali, indicando che la loro induzione era una risposta diretta innescata dall’aumento di ROS piuttosto che una trascrizione mediata da Nrf2. Dato l’elevato livello di produzione di ROS, abbiamo ipotizzato che lo stress ossidativo potesse rappresentare il principale meccanismo di morte cellulare. Per verificarlo, abbiamo utilizzato la N-acetilcisteina, un potente scavenger dei ROS, che ha completamente ripristinato i livelli di ROS ai valori basali in tutti i tempi analizzati. Sorprendentemente, questa completa neutralizzazione ha determinato solo un modesto miglioramento del 10% della vitalità cellulare, dimostrando in modo conclusivo che, sebbene la produzione di ROS sia causata dal trattamento, lo stress ossidativo non è il principale esecutore della morte cellulare. Questo risultato inatteso ci ha spinto a indagare meccanismi alternativi. L’imaging del calcio in tempo reale ha rivelato un altro meccanismo critico: entrambi i composti hanno indotto un aumento progressivo della concentrazione di calcio citosolico che iniziava circa 170 minuti dopo il trattamento e persisteva in tutte le finestre temporali esaminate. L’osservazione chiave è emersa dagli esperimenti con chelanti del calcio extracellulare e bloccanti dei canali, che non sono riusciti a prevenire l’accumulo di calcio. Ciò suggerisce che il calcio provenga da riserve intracellulari, molto probabilmente dal reticolo endoplasmatico, piuttosto che da un influsso dallo spazio extracellulare. Dopo aver studiato la citotossicità e identificato una possibile finestra terapeutica superiore della norcantaridina nei melanociti, ci siamo concentrati sullo sviluppo di una strategia di delivery mirato per aumentare ulteriormente la selettività tumorale. Sono stati valutati sistematicamente potenziali marcatori tumorali, tra cui il sistema Xc-, CD44 e le sue differenti isoforme, e i membri della famiglia EGFR (HER1, HER2, HER3). I profili di espressione hanno rivelato differenze marcate tra i tipi tumorali: le cellule di glioma esprimono prevalentemente HER1 (EGFR) con livelli più bassi di HER2 e HER3, mentre le cellule di melanoma mostrano un’espressione quasi assente di HER1 ma livelli elevati di HER2 e HER3. Anche i melanociti normali esprimono alti livelli di HER3, sollevando inizialmente preoccupazioni circa una potenziale tossicità. Tuttavia, i cheratinociti normali, che circondano i melanociti nella pelle, mostrano un’espressione minima di HER3, con solo il 4,5% delle cellule positive per il marcatore. Questo pattern di espressione, combinato con la resistenza intrinseca dei melanociti alla norcantaridina, ha suggerito che un anticorpo coniugato diretto contro HER3 potesse fornire una selettività maggiore per il melanoma risparmiando il tessuto normale circostante. È stato sviluppato un ADC coniugato con norcantaridina mirato a HER3 in configurazione DAR4, ovvero con quattro molecole di norcantaridina legate a ciascun anticorpo. La NCTD è stata coniugata tramite un linker progettato per rilasciare il carico nel compartimento lisosomiale a seguito di endocitosi mediata dal recettore. Studi di internalizzazione hanno confermato che sia l’anticorpo non coniugato sia l’ADC sono efficientemente internalizzati nelle cellule di melanoma, validando il meccanismo di uptake necessario per la somministrazione del farmaco. Gli studi di citotossicità hanno fornito una prova preliminare per l’eliminazione selettiva del tumore. Alla concentrazione di ADC corrispondente a 60 µM, le cellule di melanoma hanno mostrato una riduzione del 24% della vitalità dopo 72 ore, mentre i cheratinociti HER3-negativi hanno mantenuto invariata la vitalità. È stato dimostrato come la cantaridina e la norcantaridina siano in grado di indurre la morte cellulare in entrambi i tipi tumorali. È importante sottolineare che questi agenti bloccano la traslocazione nucleare di Nrf2, disattivando le difese antiossidanti e interferendo con diversi processi cellulari. La citotossicità potrebbe derivare dalla compromissione dell’omeostasi del calcio e del reticolo endoplasmatico e dalla disattivazione di Nrf2, mentre la produzione di ROS potrebbe agire come induttore secondario della morte cellulare. Complessivamente, i risultati di questa ricerca evidenziano come la norcantaridina sia la molecola più idonea per lo sviluppo di un ADC diretto contro HER3 mostrando una citotossicità selettiva verso le cellule di melanoma e risparmiando i cheratinociti, e pongono così le basi per strategie antitumorali di precisione.